Bioquímica Clínica On Line

6 de maio de 2012

Exames Laboratoriais – Autoanticorpos

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INTRODUÇÃO

O diagnóstico das doenças reumatológicas difusas do tecido conectivo (DDTC) baseia-se em dados clínicos, laboratoriais, histológicos e de imagens. Na tentativa de se padronizar a relevância de cada achado no diagnóstico e/ou atividade clínica da doença, as sociedades medicocientíficas estabeleceram critérios de diagnóstico para cada uma ou a um grupo relacionado de doenças reumatológicas. Alguns exames laboratoriais fazem parte desses critérios e podem contribuir para o diagnóstico e/ou acompanhamento dessas doenças. Outros, apesar de não estarem inseridos nos critérios de diagnóstico ou de atividade de doença, podem ser de utilidade no contexto global das conectivopatias, que, em geral, são muito complexas.

CONSIDERAÇÕES E TERMINOLOGIA

As doenças reumatológicas são de etiologia desconhecida, sistêmicas e apresentam comprometimento de vários órgãos e tecidos (pulmão, rim, sistema nervoso central, pele, vasos) como resultado do desenvolvimento de processos inflamatórios crônicos lesivos ao organismo cuja intensidade está associada ao grau de implicação funcional dos mesmos. Na maioria das DDTC, essa resposta inflamatória é desencadeada principalmente por mecanismos autoimunes que envolvem a ativação de células do sistema imunológico e produção de anticorpos (resposta imune humoral). A resposta autoimune humoral nas conectivopatias é induzida de forma específica por antígenos autólogos que se constituem em componentes moleculares distribuídos nas células e tecidos do próprio organismo (autoantígenos). Nesses incluem-se os ácidos nucleicos (DNA, RNA), proteínas (enzimas, proteínas constitutivas de estruturas ou organelas subcelulares), lipídios (fosfolípides distribuídos na membrana celular) ou carboidratos, além de complexos macromoleculares. Os autoanticorpos liberados na circulação interagem com o antígeno correspondente solúvel ou fixado à superfície de células ou tecidos. Esses imunocomplexos (antígeno-anticorpo), em condições normais, são removidos da circulação por uma cadeia de eventos que envolvem várias proteínas (complemento, receptores celulares) e células acessórias efetoras (fagócitos). No entanto, os imunocomplexos formados em condição de excesso de antígeno, como nas doenças autoimunes, tendem a ser de pequeno tamanho, permanecendo na circulação. Estes formam depósitos, principalmente nas paredes de pequenos vasos sanguíneos, onde desencadeiam uma série de eventos inflamatórios levando a danos teciduais com consequente sequela funcional dos mesmos.

Dentro desse contexto, a análise laboratorial nas DDTC abrange duas principais plataformas de pesquisa: avaliação da atividade inflamatória (determinação dos níveis séricos da proteína C reativa – PCR e velocidade de hemossedimentação – VHS) e da resposta imune humoral, que inclui a pesquisa de marcadores sorológicos como autoanticorpos de relevância no diagnóstico e monitoramento das conectivopatias, detecção de imunocomplexos circulantes, crioglobulinas e a determinação da atividade funcional e/ou dos níveis séricos do complemento.

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA HUMORAL

Vários autoanticorpos têm sido descritos nas DDTC, merecendo uma classificação baseada na sua relevância clínica.

 

Autoanticorpos Marcadores de Doença

São específicos de uma determinada doença nos quais se incluem, dentre outros, os anticorpos anti-dsDNA (DNA nativo ou de dupla hélice), anti-Sm e antiproteína P ribossomal encontrados exclusivamente no lúpus eritematoso sistêmico – LES (Tabela 1).

Tabela 1: Autoanticorpos marcadores de doença reumatológica

Doença reumatológica

Autoanticorpo

Lúpus eritematoso sistêmico

Anti-dsDNA, antiproteína P ribossomal, anti-Sm

Granulomatose de Wegener

cANCA1

Esclerose sistêmica forma difusa

Anti-Scl702

Esclerose sistêmica forma limitada

Anticentrômero (ACA)

Polimiosite

Anti-Jo13

Artrite reumatoide

Anti-CCP4

Doença mista do tecido conjuntivo

Anti-U1 snRNP5

Síndrome antifosfolípide primária ou secundária

Anticardiolipina (aCL)

Anticoagulante lúpico (LAC)

1 cANCA: anticorpo anticitoplasma de neutrófilos (tipo citoplasmático clássico); 2 Scl70: topoisomerase I; 3 Jo1: histidil-tRNA sintetase; 4 CCP: peptídeo citrulinado cíclico; 5 U1 snRNP: partículas ribonucleoproteicas nucleares pequenas ricas em uracila, quando encontrado em altos títulos e isoladamente no soro do paciente

 

Autoanticorpos Marcadores de Atividade e/ou Manifestação Clínica

São exemplos os anticorpos anti-dsDNA associados à nefropatia lúpica, antiproteína P ribossomal associado à psicose lúpica, cANCA com a atividade clínica da granulomatose de Wegener, anti-CCP com envolvimento extra-articular da artrite reumatoide (AR), anti-Ro/SS-A e anti-La/SSB com bloqueio cardíaco congênito e manifestação cutânea na síndrome do lúpus neonatal, anticorpos anticardiolipina e anticoagulante lúpico associados a eventos de trombose venosa e arterial, como também a complicações obstétricas.

 

Fatores Antinucleares (FAN)

É a análise laboratorial inicial e indispensável na suspeita de conectivopatias. A despeito de sua denominação, os fatores antinucleares são dirigidos a um amplo espectro de moléculas de distribuição não apenas nuclear como também citoplasmática. O teste utilizado é o de imunofluorescência indireta (IFI), empregando células humanas HEp-2 de carcinoma de laringe como substrato antigênico. O teste é semiquantitativo, permitindo a determinação do título do FAN que corresponde à recíproca da maior diluição do soro que ainda resulta em reatividade positiva na IFI. O resultado do teste é expresso como positivo ou negativo e inclui a descrição dos padrões de marcação fluorescente dos compartimentos ou organelas celulares: padrão nuclear (homogêneo, pontilhado), nucleolar, centromérico e citoplasmático (citoesqueleto, microssoma, mitocôndria) (Figura 1). A literatura tem demonstrado que alguns dos padrões exibem uma associação mais estreita com determinadas conectivopatias como o nucleolar com a esclerose sistêmica isolada ou em sobreposição com a polimiosite e, o centromérico, considerado marcador sorológico da forma limitada da esclerodermia, CREST, sendo assim de grande valor no auxilio diagnostico (Tabela 2).

Figura 1: Padrões representativos de FAN por imunofluorescência indireta em células HEp2.

 

Padrão nuclear homogêneo (A), nuclear pontilhado grosso (B), centromérico (C), nucleolar (D), citoplasmático (E), misto citoplasmático pontilhado fino e nucleolar (F), fuso mitótico (G).

Tabela 2: Padrões de FAN mais comumente observados nas conectivopatias e seus correspondentes auto-antígenos

Doença

Padrão predominante (IFI/HEp-2)

Autoantígeno alvo

LES

Nuclear:

Homogêneo

dsDNA, cromatina, histona

Pontilhado grosso

U1-snRNP, Sm

Pontilhado fino

Ro/SS-A, La/SS-B

Citoplasmático misto:

Pontilhado fino denso e nucleolar homogêneo

Proteína P ribossomal

Lúpus induzido por droga

Nuclear homogêneo

Histona

DMTC

Nuclear pontilhado grosso

U1-snRNP

Lúpus neonatal

Síndrome de Sjögren

Nuclear pontilhado fino

Ro/SS-A, La/SS-B

Esclerose sistêmica

Nucleolar aglomerado

Fibrilarina/U3-nRNP)

Nucleolar pontilhado

NOR 90, RNA pol I

Misto: nuclear homogêneo e nucleolar pontilhado

Scl70

CREST

Nuclear pontilhado centromérico

CENP-A, B e C

Polimiosite

Citoplasmático pontilhado fino

Jo1

Sobreposição PM/ES

Nucleolar homogêneo

PM/Scl

Artrite reumatoide

Homogêneo

Histonas, cromatina?

LES: lúpus eritematoso sistêmico; DTMC: doença mista do tecido conjuntivo; CREST: calcinose, Raynaud, esofagopatia, esclerodactilia, telangiectasia; ES: esclerose sistêmica; PM: polimiosite; FR: fator reumatoide

Há ainda variantes morfológicas desses padrões representativos e com relevância na investigação laboratorial das conectivopatias, com a identificação de alguns subtipos:

Subtipos de padrão nuclear pontilhado: fino (associado à presença de anticorpos anti-Sm e Ro/SS-A ou La/SS-B); grosso (sugestivo de anticorpos anti-snRNP); fino denso (observado em cerca de 30% dos soros FAN positivos, geralmente, em altos títulos. Está relacionado aos anticorpos antiproteína p75 ou LEDGF (lens epithelium derived growth factor) descritos num amplo espectro de condições clínicas inclusive em indivíduos saudáveis.

Subtipos de padrão nucleolar: homogêneo, aglomerado ou pontilhado (associados à presença de anticorpos para as proteínas PM/Scl, fibrilarina (U3-nRNP) e NOR-90, respectivamente).

Subtipos de padrão citoplasmático: pontilhado fino denso (sugestivo da presença de anticorpos antiproteína P ribossomal presentes no LES); pontilhado fino (associado aos anticorpos anti-Jo1 ou histidil-tRNA sintetase na polimiosite); fibrilar linear, filamentar ou segmentar (indicativo de anticorpos para proteínas constitutivas do citoesqueleto (actina/miosina, vimentina/queratina, a-actinina/vinculina/tropomiosina, respectivamente) detectados predominantemente em pacientes com hepatopatias).

Vários outros padrões de imunofluorescência do FAN são observados em células HEp-2, porém, até o momento, não se tem evidência da sua relevância nas conectivopatias: nuclear tipo membrana nuclear (anticorpos antilamina, envelope nuclear), nuclear pontos isolados (anti-p80 coilina, anti-Sp100 – p95), citoplasmático pontilhado polar (antigolginas), aparelho mitótico (tipo centríolo, ponte intercelular, NuMa 2), dentre outros.

 

Interpretação do Teste de FAN

A utilidade do teste do FAN é na triagem inicial dos soros quanto à presença de autorreatividade. Alta frequência e títulos elevados de FAN são observados principalmente em pacientes com LES, lúpus induzido por droga e doença mista do tecido conectivo, nos quais raramente o teste é negativo, sendo, portanto, parte dos critérios de diagnóstico. A reatividade positiva em geral, não apresenta potencialidade em diferenciar as doenças do tecido conectivo entre si, assim, FAN positivo, porém com distintos padrões de marcação celular e prevalência, é observado na esclerose sistêmica, síndrome de Sjögren, miosites idiopáticas (dermatomiosite/polimiosite), fenômeno de Raynaud e CREST, que exibe padrão de FAN exclusivo (centromérico) (Tabela 3). No entanto, o resultado positivo de FAN não se limita às DDTC, podendo ocorrer também em diversas outras doenças inflamatórias, infecciosas crônicas (virais agudas, hepatite), neoplasias e em pacientes sob uso de determinadas medicações, como hidralazina, procainamida, isoniazida e anti-TNFa.

Tabela 3: Prevalência de FAN positivo nas diferentes condições

Condição clínica

Prevalência de FAN positivo* (%)

Lúpus eritematoso sistêmico

= 95

Doença mista do tecido conjuntivo

~ 100

Lúpus induzido por droga

~ 100

Esclerose sistêmica

60 a 80

Síndrome de Sjögren

40 a 70

Dermatomiosite/polimiosite

30 a 80

Artrite idiopática juvenil (com uveíte)

20 a 50

Artrite reumatoide

30 a 50

Fenômeno de Raynaud

20 a 60

Fibromialgia

15 a 25

Normais (título =1:80)

20 a 30

* FAN por imunofluorescência indireta em células HEp-2.

Não parece haver correlação entre o título do FAN e a atividade clínica do LES, esclerose sistêmica, polimiosite/dermatomiosite, síndrome de Sjögren e artrite reumatoide. Dessa forma, a detecção seriada dos seus níveis não parece ser determinante no monitoramento da atividade clínica dessas patologias, como também é desprovida de valor prognóstico nos pacientes sabidamente FAN positivos.

É importante ressaltar que os distintos padrões de reatividade do FAN podem, na maioria das vezes e, com raras exceções, sugerir, mas não confirmar, a especificidade dos autoanticorpos. Um resultado positivo e a suspeita clínica do paciente direcionam a pesquisa subsequente dos antígenos mais relevantes associados ao padrão de imunofluorescência observado (anti-DNA nativo, histonas, proteína P ribossômica, antígenos nucleares solúveis como Sm, U1RNP, Ro/SS-A, La/SS-B, Scl70 e Jo1). Para tanto, na prática laboratorial empregam-se técnicas mais específicas e de maior sensibilidade que a IFI com preparações enriquecidas ou purificadas de antígenos-alvo solúveis (contraimunoeletroforese, imunodifusão, hemaglutinação passiva). Métodos quantitativos podem ser utilizados para determinar flutuações dos níveis dos autoanticorpos já caracterizados, pois muitos exibem associação temporal com determinadas manifestações clínicas.

A prevalência de FAN positivo, geralmente em baixos títulos (=1:80), nos indivíduos saudáveis é de 10 a 15% e pode aumentar com a idade, sendo os padrões nucleares (pontilhado, pontilhado fino denso e homogêneo) mais comumente observados nesses casos. Dessa forma, frente a um resultado de FAN positivo, é imprescindível proceder à sua titulação e à caracterização da especificidade do anticorpo envolvido.

Por outro lado, o resultado negativo não é determinante para se afastar a suspeita clínica da doença. Além disso, não exclui a presença de autoanticorpos em baixos títulos no soro ou daqueles específicos a antígenos cuja expressão celular não é suficiente para sua detecção, como o antígeno Ro/SS-A.

Autoanticorpos Anti-DNA Nativo ou de Dupla Hélice (dsDNA)

Estão presentes exclusivamente no soro de pacientes com LES, sendo, portanto, úteis no diagnóstico da doença desde que detectado por um teste de alta especificidade como a IFI utilizando o hemoflagelado Crithidia luciliae como substrato (Figura 2). O resultado positivo na IFI, independentemente do título, é altamente sugestivo de LES (95% de especificidade para a doença). Outra opção é a técnica de enzimaimunoensaio (ELISA) utilizando preparações purificadas de DNA de células eucarióticas, bactérias ou na forma de plasmídeo circular, útil no acompanhamento das flutuações desse anticorpo. No teste do FAN, sua presença está associada ao padrão nuclear homogêneo.

Figura 2: Reatividade dos anticorpos anti-dsDNA por imunofluorescência em C. luciliae com marcação do cinetoplasto.

 

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: são específicos do LES, sendo sua detecção de grande valor diagnóstico. Fazem parte dos critérios da American Rheumatism Association para o diagnóstico do LES. Estão presentes em 40 a 60% dos pacientes com LES em geral, 70 a 95% com LES ativo e em 20 a 30% com LES inativo. A monitoração dos seus níveis séricos deve ser feita no acompanhamento clínico do paciente sendo que um aumento no seu título pode prever a exacerbação da doença. Apresenta um valor prognóstico, em particular, quando acompanhado da queda concomitante do complemento.

 

Autoanticorpos Anti-histonas

São detectados por ELISA ou immnoblot utilizando preparações purificadas das diferentes histonas (H1, H2A, H2B, H3 e H4). No teste do FAN, sua presença está associada ao padrão nuclear homogêneo.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: o resultado positivo associado à ausência de outros anticorpos sugere fortemente o diagnóstico de lúpus induzido por droga. Anticorpos contra os diferentes tipos de histona podem ser identificados no soro de 30 a 70% dos pacientes com LES idiopático e em praticamente todos com síndrome do lúpus induzido por drogas como procainamida, hidralazina, isoniazida, D-penicilamina dentre outras. Entretanto, esses anticorpos também podem estar presentes numa variedade de outras doenças autoimunes ou infecciosas crônicas.

 

Anticorpos Antinucleossoma ou Anticromatina

Nos últimos anos, tem se fortalecido a relevância desses anticorpos que exibem especificidade para o complexo constituído por um octâmero de histonas, ao redor do qual se dispõe a molécula de dsDNA. O método de escolha para a sua detecção é a técnica de ELISA empregando o antígeno purificado. No teste do FAN, sua presença está associada ao padrão nuclear homogêneo.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: anticorpos antinucleossoma (aNucl) estão presentes em 75 a 88% dos pacientes com LES. Esses anticorpos mostram uma associação com a atividade clínica e renal da doença, sendo sua pesquisa útil em seu diagnóstico e no monitoramento de atividade, sobretudo, nos pacientes que são negativos para os anticorpos anti-dsDNA. Os aNucl são especialmente prevalentes nos pacientes com nefrite lúpica e aparentemente são detectados mais precocemente que os anticorpos anti-dsDNA.

 

Anticorpos Anti-Sm e Anti-RNP

Esses autoanticorpos são específicos aos antígenos extraíveis com solução fisiológica (extractable nuclear antigens ou ENA), principalmente as ribonucleoproteínas Sm e RNP. No teste do FAN, a presença de anticorpos anti-RNP e Sm está associada ao padrão nuclear pontilhado grosso. A especificidade desses autoanticorpos é determinada por hemaglutinação passiva, imunodifusão dupla em gel ou contraimunoeletroforese empregando extratos teciduais (timo ou baço) como fonte de antígenos. Os anticorpos anti-Sm são altamente específicos do LES (99% de especificidade para a doença) e estão incluídos nos critérios de diagnóstico do mesmo sendo sua prevalência de 15 a 30%. A presença de anticorpos anti-Sm no LES, ao contrário dos anticorpos anti-dsDNA, não parece estar associada a alguma manifestação clínica em particular. Já os anticorpos anti-RNP podem estar presentes num amplo espectro de doenças reumatológicas (LES exibindo associação com o fenômeno de Raynaud, esclerose sistêmica e síndrome de Sjögren). Entretanto, quando presentes isoladamente e em altos títulos, fazem parte dos critérios de diagnóstico da doença mista do tecido conjuntivo (DMTC).

 

Anticorpos Anti-Ro/SS-A e Anti-La/SS-B

São determinados por imunodifusão dupla, contraimunoeletroforese e ELISA empregando extrato de baço ou as proteínas purificadas ou recombinantes (ELISA). No teste do FAN, esses anticorpos exibem padrão nuclear pontilhado fino. Podem ser detectados no soro de pacientes com síndrome de Sjögren (60 a 75%), LES (25 a 50%) e na síndrome do lúpus neonatal (> 95%). A determinação dos anticorpos anti-Ro/SS-A é de interesse e significado no diagnóstico clínico do LES na ausência de outro marcador sorológico (anticorpos anti-dsDNA e anti-Sm), bem como no diagnóstico da síndrome de Sjögren (SS), podendo ser detectados, nesse caso, isoladamente ou associados, com maior frequência, ao autoanticorpo anti-La/SS-B. Na síndrome do lúpus neonatal, os anticorpos anti-Ro/SS-A estão associados ao bloqueio cardíaco e/ou manifestação cutânea do recém-nascido. Os anticorpos anti-Ro/SS-A e anti-La/SS-B apresentam alta especificidade de diagnóstico para a síndrome de Sjögren, fazendo, portanto, parte do critério para a classificação dessa síndrome. A identificação dos anticorpos anti-Ro/SS-A e anti-La/SS-B é um achado sorológico estável, já que seus níveis séricos não parecem flutuar no curso da doença. Nos casos de SS primária, o anticorpo anti-La/SS-B aparece em 40% dos pacientes, e, no LES, em 6 a 15% dos casos. Além disso, este anticorpo é detectado quase unicamente nos pacientes que são anti-Ro/SS-A positivos, sendo o inverso não verdadeiro.

 

Anticorpos Anti-Scl70 e Anti-Jo1

Os métodos de escolha para a determinação desses autoanticorpos são imunodifusão dupla em gel, immunoblotting e a técnica de ELISA. O anticorpo anti-Scl70 é considerado marcador diagnóstico da esclerose sistêmica sendo encontrado em 60% dos pacientes com a forma cutânea difusa da doença. Quando presenteaumenta o risco de desenvolvimento de fibrose pulmonar nesses pacientes. No teste do FAN está associado ao padrão nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafásica positiva. Já o anticorpo anti-Jo-1 é considerado marcador sorológico de um subgrupo de polimiosite inflamatória idiopática no adulto, particularmente com quadro de doença pulmonar intersticial, fenômeno de Raynaud, mãos de mecânico e artralgia, denominada síndrome antissintetase. Cerca de 30% dos pacientes adultos com polimiosite são anti-Jo1 positivos e essa frequência é maior (60%) em pacientes com comprometimento intersticial pulmonar. No teste do FAN, sua presença está associada ao padrão citoplasmático pontilhado fino.

 

Anticorpos Anticentrômero

Os antígenos-alvo desses anticorpos são proteínas constitucionais centroméricas. No teste do FAN em células HEp-2, sua presença está associada ao padrão nuclear pontilhado (número de 46 pontos) na célula em intérfase e quando em divisão esses pontos se alinham na placa metafásica. Esse é um dos raros casos onde o padrão do FAN é determinante não havendo a necessidade de caracterização subsequente da especificidade do autoanticorpo por outro teste.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: os anticorpos anticentrômero (ACA) são específicos de pacientes com a forma limitada de esclerose sistêmica ou síndrome CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, alteração motora do esôfago, e esclerodactilia e telangiectasia), sendo detectados numa frequência de 70% dos casos. Por outro lado, são encontrados numa menor frequência (20%) nos pacientes com a forma sistêmica da ES. Além disso, os pacientes com fenômeno de Raynaud primário e ACA positivos podem desenvolver a síndrome de CREST.

 

Anticorpos Antiproteína P Ribossômica

Na IFI em células HEp-2, esse anticorpo apresenta padrão citoplasmático fino e difuso, e sua especificidade pode ser confirmada por immunoblotting. Alternativamente, a técnica de ELISA também pode ser utilizada com a vantagem de possibilitar a determinação dos níveis séricos desses anticorpos que se mostram alterados durante o curso do LES.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: a presença de anti-P é altamente específica para o diagnóstico de LES, sendo detectados em cerca de 10% desses pacientes, mas essa frequência aumenta até 40% naqueles com doença ativa. Há uma forte correlação do anticorpo antiproteína P ribossomal com distúrbios neuropsiquiátricos do LES, principalmente psicose e depressão, bem como com hepatite crônica ativa (em crianças com LES juvenil) e a glomerulonefrite membranosa no LES.

 

Outros Autoanticorpos

 

Anticorpos Anticitoplasma de Neutrófilos (ANCA)

Interagem com proteínas dos grânulos azurófilos primários dos neutrófilos e estão fortemente associados às vasculites primárias, granulomatose de Wegener (60-90%), poliangiíte microscópica, síndrome de Churg-Strauss dentre outras. Os principais antígenos-alvo são:a proteinase 3 (PR3) e a mieloperoxidase (MPO), embora reatividade a outros antígenos presentes em lisossomas de neutrófilos, monócitos e células endoteliais também tenha sido descrita. ANCA é detectado por IFI em neutrófilos humanos fixados em álcool como substrato antigênico e pode se expressar por dois padrões de fluorescência: padrão granular fino do citoplasma ou ANCA clássico (cANCA), sugestivo de anticorpos anti-PR3 e, o perinuclear ou pANCA, sugestivo de anticorpos específicos para a MPO, assim como para elastase, catepsina G e lactoferrina (Figura 3). A positividade por IFI em neutrófilos não é suficiente como parâmetro de diagnóstico de Wegener ou de poliangiíte microscópica. Assim, as amostras de soro devem ser analisadas também por ELISA, utilizando os antígenos purificados (PR3 e MPO) para alcançar uma especificidade de diagnóstico de 99%.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: ANCA mostra-se associado às doenças inflamatórias idiopáticas inclusive intestinais, glomerulonefrites rapidamente progressivas, hemorragia pulmonar, vasculites cutâneas, nódulos múltiplos pulmonares e doença crônica destrutiva das vias aéreas superiores. O anticorpo cANCA é mais comumente detectado em pacientes com granulomatose de Wegener ( 90% quando em atividade) e é altamente específico dessa doença, constituindo-se, assim, num marcador sorológico para essa patologia. Além disso, tem valor no acompanhamento clínico/terapêutico desses pacientes. cANCA também pode ocorrer, com menor frequência, na poliangiíte microscópica (20%) e na vasculite de Churg-Strauss (10%) e, raramente, em indivíduos normais. Por outro lado, o pANCA é um padrão observado num espectro maior de doenças, como poliangiíte microscópica (50%) e síndrome de Churg-Strauss (50%), glomerulonefrite crescente idiopática, colagenoses (AR), em doenças induzidas por drogas (propiltiouracil, utilizado no tratamento do hipertireoidismo) e inflamações crônicas do intestino (Tabela 4).

Figura 3: Padrões representativos de ANCA por imunofluorescência indireta em neutrófilos humanos.

 

Padrão citoplasmático clássico (cANCA) (A), padrão perinuclear (pANCA) (B).

Tabela 4: Frequência dos anticorpos anticitoplasma de neutrófilo em diferentes condições clínicas

Condição clínica

PR3 cANCA (%)

MPO/não MPO

pANCA (%)

Granulomatose de Wegener

30 a 90

MPO (24)

Poliangiíte microscópica

20 a 40

MPO (58)

Síndrome de Churg-Strauss

< 5 a 10

MPO (50)

Glomerulonefrite crescente idiopática

30

MPO (64)

Artrite reumatoide

Não MPO (20 a 30)

Colite ulcerativa

Não MPO (60 a 80)

Doença de Cröhn

Não MPO (15 a 20)

Hepatite autoimune tipo I

Não MPO (85 a 95)

PR3: proteinase 3; MPO: mieloperoxidase.

 

Anticorpos Antipeptídeo Cíclico Citrulinado

Anticorpos que reconhecem as subunidades da proteína filagrina epidérmica têm como epítopos resíduos do aminoácido arginina convertidos em citrulina. Esses anticorpos são detectados por ELISA que emprega peptídeos cíclicos citrulinados (CCP) sintéticos como antígeno.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: o diagnóstico da AR depende primariamente das manifestações clínicas, já que tem suporte sorológico limitado e a determinação do FR é ainda o teste mais rotineiramente utilizado. Estudos caracterizando a frequência dos anticorpos anti-CCP nas doenças reumáticas, infecciosas e população normal mostraram que sua detecção é altamente específica (98%) e moderadamente sensível (68%) para a AR, sendo também detectados na artrite idiopática juvenil, porém, não em indivíduos saudáveis. Os anticorpos anti-CCP têm uma sensibilidade de diagnóstico similar a do FR no início da AR, mas se tornam um melhor marcador preditivo do curso da doença após alguns anos. A determinação dos títulos séricos do anticorpo anti-CCP, isoladamente ou em conjunto com FR, é de grande valor preditivo para o prognóstico ou de gravidade de doença, já que altos títulos do anticorpo estão associados à progressão erosiva óssea da AR e, portanto, são marcadores da forma mais agressiva da doença com pior prognóstico. Até o momento, este teste é o de escolha em pacientes com poliartrite não diagnosticada ou FR negativo e, assim, sua detecção na prática laboratorial aumenta o valor preditivo positivo para a AR. Além disso, a relevância do anticorpo anti-CCP parece residir em seu valor diagnóstico e sua associação com as formas mais graves e ativas da doença, especialmente nos pacientes que são FR negativos.

 

Fatores Reumatoides (FR)

São autoanticorpos específicos para determinantes antigênicos constitutivos da região constante C-terminal da cadeia pesada, porção Fc, da molécula de IgG autóloga. São, em geral, da classe IgM de imunoglobulina embora tenham sido também identificados anticorpos dos isótipos IgG, IgA ou mesmo IgE e IgD. Vários métodos têm sido utilizados para a determinação de FR no soro: ELISA, radioimunoensaio e os mais utilizados nefelometria, aglutinação passiva tanto de hemácias sensibilizadas com IgG de coelho (técnica de Waaler-Rose) como de partículas de látex ou bentonita cobertas com IgG humana agregada (técnica de Singer & Plotz) como antígeno.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: em geral, são muito mais frequentes na AR, merecendo, assim, a designação de FR, embora possam estar presentes em outras patologias (Tabela 5). O teste de látex é positivo em 75 a 90% dos pacientes com artrite reumatoide e o de Waaler-Rose, embora de menor sensibilidade, tem se mostrado mais específico para auxílio no diagnóstico dessa patologia. Existe uma forte correlação entre título de FR e gravidade da doença. Assim, é comum pacientes com manifestações extra-articulares (nódulos, pleurite, pericardite, episclerite, úlceras e vasculite) apresentarem títulos bastante elevados de FR. No entanto, ainda é controverso o uso do teste para monitorar a atividade clínica da doença ou a eficiência terapêutica. Nesses casos, as provas de atividade inflamatória (PCR e VHS) mostram maior utilidade.

O teste positivo ou negativo não confirma nem exclui AR, respectivamente. De fato, o exame não exibe especificidade para essa doença, já que FR em títulos elevados pode ser detectado também na síndrome de Sjögren, doença mista do tecido conjuntivo e crioglobulinemias, particularmente do tipo misto e, em títulos baixos, no LES. Também sua ausência não exclui o diagnóstico de AR, já que 10% destes pacientes não têm FR no soro, porém, quanto mais altos os níveis de FR, maior sua especificidade para a doença. Além disso, 2 a 10% dos indivíduos normais podem apresentar FR em baixos títulos, prevalência esta que pode chegar a 40% nos indivíduos com idade acima de 75 anos. Presença transitória de FR em indivíduos normais também pode ser detectada após infecções ou imunizações, provavelmente exercendo um papel facilitador na remoção de complexos imunes da circulação.

Tabela 5: Prevalência do fator reumatoide em diversas condições clínicas

Condição clínica

Fator reumatoide – Prevalência (%)

Artrite reumatoide

75 a 90

Artrite reumatoide juvenil

5 a 20

Síndrome de Sjögren primária

20 a 30

Lúpus eritematoso sistêmico

15 a 35

Esclerose sistêmica

20 a 30

Doença mista do tecido conjuntivo

50 a 60

Crioglobulinemia mista

90 a 100

Infecções crônicas

10 a 50

Normais adultos (20 a 60 anos)

2 a 10

 

Anticorpos Antifosfolípides

Incluem-se nesse grupo aqueles anticorpos que reagem com o fosfolipídeo cardiolipina (aCL), que é um componente natural da membrana celular, e o anticoagulante lúpico (LAC), que reage com fatores da coagulação. São geralmente do isótipo IgG e IgM e estão associados à síndrome antifosfolípide primária ou secundária a uma doença reumatológica, caracterizada por episódios trombóticos venosos e/ou arteriais, plaquetopenia e abortos de repetição. A ligação do anticorpo anticardiolipina é mediada pelo cofator b2Glicoproteína (b2GPI). Assim, os aCL são detectados no soro ou plasma por ELISA empregando o fosfolípide purificado na presença de soro bovino como fonte de co-fator b2GPI e soros referência com diferentes unidades de aCL.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: níveis elevados de IgG aCL-dependente do cofator b2GPI no LES e na síndrome antifosfolípide primária (SAF) estão associados com um alto risco de trombose e abortos de repetição. O valor de diagnóstico dos aCL dependentes de b2GPI baseia-se nos critérios laboratoriais estabelecidos: aCL IgG e/ou IgM positivo com níveis moderados a altos, quando detectado por ELISA seguindo condições metodológicas padronizadas internacionalmente, em duas ou mais ocasiões com intervalo de pelo menos 6 semanas. O intervalo estabelecido entre as determinações é fundamental para excluir falsa-positividade decorrente de infecções transitórias (p. ex.: sífilis, AIDS) ou ainda, falsa-negatividade, que pode ser observada na ocorrência do evento de trombose associado à síndrome. Ainda não está comprovada a utilidade do teste no acompanhamento longitudinal desses pacientes, no entanto, já foi demonstrado que os títulos destes anticorpos podem cair na vigência do episódio de trombose. Assim, nos casos que ainda não se tem diagnóstico, o exame deve ser repetido no período estabelecido de 6 semanas e 6 meses após o quadro vascular. Em alguns casos, como na arterite de célula gigante, o monitoramento dos níveis de aCL parece ser útil na detecção de atividade e remissão da doença.

 

Anticoagulante Lúpico

É um anticorpo que interfere com um ou mais testes de coagulação dependente de fosfolípides e sua detecção faz parte também dos critérios da SAF. Sua identificação no plasma requer uma análise sequencial que compreende três fases: determinação do prolongamento do TTPA, identificação da presença de inibidor da coagulação pela adição de plasma normal e confirmação da dependência da atividade de coagulação por fosfolípides pela adição de plaquetas ou do fosfolípide isoladamente. A detecção de aCL por ELISA deve ser feita concomitantemente à determinação do LAC, embora a concordância destes dois anticorpos ocorra somente em 60% dos casos.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: atividade LAC é observada persistentemente em doenças autoimunes, síndrome primária do anticorpo antifosfolípide (SAFP) ou secundária (associada ao LES ou a outra conectivopatia) e, especialmente nesses casos, exibe estreita relação com as manifestações clínicas dessas patologias. A presença no plasma do LAC, similarmente aos anticorpos aCL, mostra uma associação bastante importante com eventos de trombose, trombocitopenia e abortos espontâneos de repetição observados na síndrome antifosfolípide. Porém, o anticoagulante lúpico pode estar presente transitoriamente num grande número de situações clínicas aloimunológicas, doenças infecciosas ou tumorais.

OUTROS PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS

 

Complexos Imunes Circulantes

Complexos antígeno-anticorpo formados em condições de excesso de antígeno são em geral, pequenos, solúveis e ineficientemente removidos pelo sistema retículo-endotelial, podendo, assim, ser detectados em diferentes fluidos biológicos. Os testes de ELISA e nefelometria comumente utilizados na prática laboratorial para sua detecção baseiam-se na reatividade desses complexos com componentes do sistema complemento C1q e/ou C3.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: os complexos imunes circulantes parecem ter um papel importante na patogênese das doenças autoimunes e geralmente cursam com evidente consumo de complemento. Altas concentrações são observadas em doenças reumatológicas ativas, vasculites, neoplasias e doenças infecciosas. Entretanto, apesar do reconhecido interesse, a utilidade clínica desse teste não está estabelecida, uma vez que não existe uma correlação estreita entre a presença dos complexos imunes na circulação e a atividade de doença ou o grau de lesão tecidual.

 

Crioglobulinas

Grupo de proteínas que, sob baixas temperaturas , formam agregados insolúveis que se precipitam e tendem a se dissolver sob posterior aquecimento a 37° (Figura 4). A análise de seus componentes possibilita sua classificação em três tipos:

crioglobulina tipo I: imunoglobulina monoclonal (IgG, IgM ou IgA ou raramente proteína de Bence-Jones) sem atividade de FR e não fixa complemento;

crioglobulina mista do tipo II: imunoglobulinas monoclonais (IgM, IgG ou IgA), geralmente com atividade de FR, associadas à IgG policlonal, podendo ainda conter ou não antígenos próprios ou microbianos; fixam complemento;

crioglobulina mista tipo III: imunoglobulinas de origem policlonal e, geralmente, uma delas com atividade de FR; fixam complemento.

Para sua determinação, colhe-se o sangue em tubo pré-aquecido que deve ser rapidamente encaminhado ao laboratório para coagulação a 37° C por, pelo menos, 30 min. O soro é mantido na geladeira por alguns dias para possibilitar a formação de crioprecipitado, que é lavado e solubilizado quando aquecido. O teor proteico é determinado por técnicas bioquímicas e valores = 80 mg/mL são considerados positivos. A caracterização das imunoglobulinas constituintes do crioprecipitado pode ser feita pela técnica de imunodifusão dupla ou imunoeletroforese, utilizando anti-soros específicos para cada isótipo.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: a macroglobulinemia de Waldenströn e o mieloma múltiplo podem levar à formação in vitro de crioprecipitados com características do tipo I ou monoclonal associados a sintomas da síndrome de hiperviscosidade (cefaleia, gengivorragia, hemorragia retiniana, zumbido) e de púrpura, fenômeno de Raynaud, cianose, ulceração. Crioglobulinas tipo II são comuns em doenças infecciosas crônicas, sobretudo envolvendo o vírus da hepatite B e principalmente o da hepatite C, que é a causa mais comum de crioglobulinemia. Nas conectivopatias, a crioglobulina mista do tipo II, é observada na artrite reumatoide e síndrome de Sjögren. Já a crioglobulina mista do tipo III é observada em algumas doenças reumáticas como LES, artrite reumatoide, mas também ocorre em doenças infecciosas crônicas, virais, bacterianas e parasitárias. A formação de grandes quantidades de precipitado está associada principalmente à crioglobulinemia essencial, e a análise imunoeletroforética deste material pode evidenciar imunoglobulinas monoclonais como um dos componentes. Pó outro lado, as crioproteínas frequentemente detectadas no LES costumam ser em quantidades menores. Dentre as manifestações clínicas mais importantes associadas à presença de crioprecipitados do tipo misto incluem-se fenômeno de Raynaud, vasculites, ulceração cutânea, necrose, acrocianose, púrpura e nefrite.

Figura 4: Formação de crioprecipitado no soro mantido 3 dias a 8°C.

 

A: soro negativo; B: soro positivo.

 

Complemento

O complemento constitui-se numa série de proteínas séricas produzidas pelo fígado e que, na presença de ligantes, complexos imunes circulantes ou microrganismos, são ativadas de maneira sequencial, tendo a lise celular como evento final. A ativação desse sistema ocorre pela interação inicial com a molécula C1q do componente C1, via clássica, ou diretamente com o componente C3, via alternativa, resultando ambas na ativação dos componentes terminais (C5-C9).

A análise funcional do sistema de complemento consiste na determinação da sua atividade hemolítica. Os resultados são expressos em unidades hemolíticas (CH50) que correspondem à diluição do soro, que produz 50% de lise do sistema hemolítico (hemácias de carneiro sensibilizadas por anticorpos específicos). Devido à acentuada termolabilidade de alguns componentes do complemento, o soro deve ser manuseado e congelado rapidamente por curto período. A avaliação dos níveis séricos dos componentes C3 e C4 é habitualmente feita pela técnica de imunodifusão radial e não necessita de sangue fresco.

Interpretação e significado clínico em Reumatologia: a diminuição da atividade hemolítica reflete geralmente o consumo de complemento in vivo pelo desenvolvimento de processo inflamatório envolvendo formação de complexos imunes circulantes. No LES, o complemento é um excelente parâmetro para monitoração da atividade de doença e resposta terapêutica, em especial, naqueles pacientes com acometimento renal. Por outro lado, atividade hemolítica reduzida pode sugerir também deficiências seletivas de complemento, em particular aquelas dos componentes C2 e C4, as quais podem estar associadas ao LES ou síndrome “lúpus-like” que costuma se apresentar com FAN negativo. Existem ainda outras condições que podem cursar com o complemento baixo sem evidência de formação de complexos imunes, como choque séptico, falência hepática, pancreatite, síndrome hemolítica urêmica, infecções gonocócicas de repetição, entre outras. Elevação dos níveis de complemento também pode ocorrer nas doenças reumáticas como resultado de síntese aumentada associada ao grupo de outras proteínas da resposta inflamatória de fase aguda.

 

Análise do Líquido Sinovial

O líquido sinovial (LS) normal apresenta um teor proteico 30% menor (2 g/dL) que o do soro e é praticamente acelular (< 100 leucócitos/mm3 e ausência de hemácias). Durante o processo inflamatório acometendo as articulações, ocorrem alterações marcantes na sua composição e sua análise laboratorial torna-se de grande valor prognóstico e de diagnóstico. A artrocentese requer familiaridade com a anatomia articular e deve ser realizada assepticamente por pessoal clínico qualificado. A amostra de LS deve ser colhida na presença de anticoagulante (heparina sódica) e examinada no prazo de 2 horas após sua aspiração.

A análise do LS compreende avaliação da sua coloração, grau de limpidez, viscosidade, celularidade (leucócitos e hemácias) e presença de cristais. O LS normal apresenta coloração amarela, de alta viscosidade, límpido, acelular e sem hemácias, contrastando com as efusões inflamatórias não infecciosas, que se apresentam com baixa viscosidade mas podem se apresentar opacas ou turvas como resultado da celularidade aumentada (12.000 a 50.000 céls/mm3) ou ainda com fibrina e cristais. Os polimorfonucleares são as células predominantes no LS inflamatório, constituindo 50 a 90% dos leucócitos totais. Há certa correlação entre a aparente gravidade dos sintomas clínicos e o número de leucócitos nas efusões sinoviais. Desta forma, valores superiores a 100.000 céls/mm3 estão associados a processos inflamatórios infecciosos agudos. Assim, a detecção de um aumento extremamente alto no número de leucócitos implica no encaminhamento da amostra de LS para a realização de cultura microbiológica. Em geral, doença articular não infecciosa com celularidade moderada (< 5.000 céls/mm3) é observada no LES e na esclerodermia sistêmica. Já a doença inflamatória articular grave (5.000 a 50.000 leucócitos/mm3) está presente na AR, gota, pseudogota e febre reumática.

A análise do LS se completa com a pesquisa de cristais na amostra sob microscopia de luz polarizada: cristais de urato monossódico em forma de agulha, livres ou intracelulares e com forte birrefringência negativa, os quais são patognômicos da gota; cristais de pirofosfato de cálcio diidratado sem forma definida e pouco birrefringentes; cristais de colesterol caracterizam-se por placas grandes multicoloridas com bordas arredondadas e de distintas formas e características ópticas. Ao contrário dos anteriores, cristais de colesterol não são fagocitados por polimorfonucleares, e sua presença não está associada à celularidade do LS.

TÓPICOS IMPORTANTES

A análise laboratorial das DDTC inclui pesquisa de autoanticorpos, avaliação da atividade inflamatória, detecção de imunocomplexos, crioglobulinas e complemento.

Muitos autoanticorpos são específicos de determinadas doenças autoimunes, sendo de grande valia no diagnóstico, como anti-dsDNA, antiproteína P ribossomal, anti-Sm (LES), cANCA (granulomatose de Wegener), Anti-Scl70 (esclerose sistêmica), anti-centrômero (CREST) anti-Jo1 (polimiosite no adulto), anti-CCP (artrite reumatoide), Anti-U1 snRNP (doença mista do tecido conjuntivo, quando em altos títulos e isoladamente), anticardiolipina e anticoagulante lúpico (síndrome antifosfolípide primária ou secundária).

Existem anticorpos que, quando presentes, são também marcadores de atividade ou manifestação clínica das doenças autoimunes, por exemplo, anti-dsDNA (associado à nefropatia lúpica), antiproteína P ribossomal (associado à psicose lúpica), cANCA (atividade clínica da granulomatose de Wegener) e anti-CCP (envolvimento extra-articular da AR).

O FAN é semiquantitativo, e quando em títulos altos são sugestivos da ocorrência de doença autoimune . Os diferentes padrões de marcação fluorescente (padrão nuclear, nucleolar, e citoplasmático) não são, em geral, específicos de uma determinada patologia, exceto o padrão centromérico, considerado marcador sorológico da CREST.

É importante ressaltar que os distintos padrões de reatividade do FAN podem sugerir, mas não confirmar, a especificidade dos autoanticorpos. Um resultado positivo e a suspeita clínica do paciente direcionam a pesquisa subsequente dos antígenos mais relevantes associados ao padrão de imunofluorescência observado (anti-DNA nativo, histonas, proteína P ribossômica, antígenos nucleares solúveis como Sm, U1RNP, Ro/SS-A, La/SS-B, Scl70 e Jo1).

A prevalência de FAN positivo em células HEp-2, geralmente em baixos títulos (1:80), nos indivíduos saudáveis é de 10 a 15% e pode aumentar com a idade, sendo os padrões nucleares (pontilhado, pontilhado fino denso e homogêneo) mais comumente observados nesses casos. Dessa forma, frente a um resultado de FAN positivo, é imprescindível proceder à sua titulação.

Autoanticorpos Anti-DNA nativo ou de dupla hélice são específicos do LES, sendo sua detecção de grande valor diagnóstico. A monitoração dos seus níveis séricos deve ser feita no acompanhamento clínico do paciente, pois têm valor prognóstico, em particular, quando acompanhado da queda concomitante do complemento.

Autoanticorpos anti-histonas na ausência de outros anticorpos sugerem fortemente o diagnóstico de LES induzido por droga

Anticorpos anti-Sm são altamente específicos do LES e estão incluídos nos critérios diagnósticos da doença.

Os anticorpos Anti-RNP estão presentes em um amplo espectro de doenças reumatológicas (principalmente LES, esclerose sistêmica e síndrome de Sjögren), mas quando presentes isoladamente e em altos títulos, fazem parte dos critérios de diagnóstico da doença mista do tecido conectivo.

Anticorpos anti-Ro/SS-A e Anti-La/SS-B podem ser detectados no soro de pacientes com síndrome de Sjögren, LES e na síndrome do lúpus neonatal.

Anticorpo anti-Scl70 é marcador diagnóstico de esclerose sistêmica e anticorpos anticentrômero (ACA) são específicos da forma limitada da doença (síndrome CREST).

Anticorpo anti-Jo1 é marcador diagnóstico de polimiosite e está presente em 30% dos casos em adultos

Anticorpos antiproteína P ribossomal são altamente específicos para diagnóstico de LES e há forte relação de sua positividade com distúrbios neuropsiquiátricos do LES, principalmente psicose e depressão, bem como com hepatite crônica ativa (em crianças com LES juvenil) e glomerulonefrite membranosa no LES.

O anticorpo cANCA é mais comumente detectado em pacientes com granulomatose de Wegener (80 a 90% quando em atividade clínica) e é altamente específico dessa doença.

O pANCA é observado num espectro maior de patologias, como algumas vasculites (poliangiíte microscópica (60%), síndrome de Churg-Strauss (50%), colagenoses (AR), em doenças induzidas por drogas e inflamações crônicas do intestino.

Anticorpos antipeptídeo cíclico citrulinado (Anti-CCP) são altamente específicos (98%) e moderadamente sensíveis (68%) para a AR, além de serem marcadores de formas mais agressivas da doença.

O fator reumatoide faz parte dos critérios diagnósticos da AR, mas não é específico para a doença, podendo ser detectado na síndrome de Sjögren, LES, doença mista do tecido conjuntivo, crioglobulinemias mistas, infecções crônicas e até mesmo em adultos saudáveis. A sua ausência também não excluí o diagnóstico de AR.

Anticorpos antifosfolípides (anticardiolipina e anticoagulante lúpico) estão associados à síndrome antifosfolípide primária ou secundária, que é uma doença reumatológica caracterizada por episódios trombóticos venosos e/ou arteriais, plaquetopenia e abortos de repetição.

A macroglobulinemia de Waldenströn e o mieloma múltiplo estão associados à formação de crioglobulinas do tipo I ou monoclonal

Crioglobulinas tipo II são comuns em doenças infecciosas crônicas, sobretudo envolvendo o vírus da hepatite B e principalmente o da hepatite C, que é a causa mais comum de crioglobulinemia.

Crioglobulina mista do tipo III é observada em algumas doenças reumáticas como LES, artrite reumatoide e em doenças infecciosas crônicas, virais, bacterianas e parasitárias.

No LES, o complemento é um excelente parâmetro para monitoração da atividade de doença e resposta terapêutica, em especial, naqueles pacientes com acometimento renal.

Existem outras condições que podem cursar com o complemento baixo sem evidência de formação de complexos imunes, como choque séptico, falência hepática, pancreatite, síndrome hemolítica urêmica, infecções gonocócicas de repetição, entre outras.

A análise do LS compreende avaliação da sua coloração, grau de limpidez, viscosidade, celularidade (leucócitos e hemácias) e presença de cristais.

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